低音提琴定弦方法复杂。目前通用的是四弦四度定弦：从高到低 G, D, A, E。这样的定弦中，低音提琴能演奏的最低音为Kontra E。为了求得最低音与大提琴的八度关系，欧美的交响乐队都力争至少将低音提琴的最低音扩展至Kontra C。
具体而言，有两种方法可以做到：
流行于德奥等地的方法为增加第五弦。第五弦早期为C弦，这样第五弦与第四弦构成大三度，在指法上颇有不便，但C弦发音较易，张力上的要求在早期技术水准上容易达到。随着技术发展，德奥等地使用的第五弦一般为B弦，与第四弦构成纯四度，指法便利。弦的张力问题通过制琴技术发展也已解决。
流行于其他国家的方法是，为第四弦增加变调器，使在常规上发空弦E音的第四弦，经过变调后发C音。
除此以外，早期的低音提琴尚有3弦五度定弦法（一度流行与意大利等地的独奏低音提琴家）、3弦4度定弦法等等，今已淘汰。今日有少数低音提琴家主张4弦5度定弦（ADGC）。由于这种定弦要求演奏者的手足够大，且对传统的低音提琴指法、把位体系有彻底改动，因此尚未流行开。
低音提琴的低音为其粗一根弦的（在有变调器的情况下，全部展开其变调装置后的）空弦音。因此，应该是Subkontra H（德奥五弦琴），或者是Kontra C（英美乐队琴），或者是Kontra E（普通四弦乐队琴）。其最高音的音域难于估量，因为在独奏作品中，适当使用泛音可以大幅扩展低音提琴的高音音域。在乐队中，其最高音一般为小字组g（主要见于古典至浪漫派交响作品），但也可用至小字一组的g1（多见于现代风格交响作品）。
独奏低音提琴使用不同于乐队低音提琴的定弦。使其音色更为突出而明亮在原本的定弦上，每个弦向上调一个全音（大二度）。从高到低分别为 A-E-B-F#。独奏低音提琴是个需要改变谱号的移调乐器。记谱往往是相对作曲家所谱写的原调低一个全音（大二度）的调式。例如原本为E大调，实际记谱则为D大调。以便演奏者演奏时，按照原本定弦的指法正常演奏。
在交响乐队中的地位
低音提琴负责的是交响乐队最低音的声部（但不是最低音的乐器。低音巴松管和大号的音域可以比低音提琴的最低音弦，不管是E弦还是C弦更低，甚至一个有意往低音吹的次中音长号也能超出常用音域而做到这一点），主要是因为低音提琴齐奏的低音是整个乐队里最好的低音，浑厚而有弹性，比相同音域的木管或铜管乐器都要显得润泽有活力一些。另一个原因是低音提琴的演奏技术是灵活的（和近似音域的乐器比），让优秀的乐队低音提琴演奏很快的段落，并不是特别吃亏，但让低音巴松管吹奏很快的段落，就比较吃亏了。
在交响乐里，低音提琴最常见的演奏方式是和大提琴演奏同一段乐谱。当他和大提琴演奏同样的乐谱的时候，实际上二者是在隔八度演奏。这样的低音，是效果非常好的。如果没有低音提琴，光大提琴，则声音不够深沉有力；如果没有大提琴，光低音提琴，则声音不够清晰灵活，二者结合是最好的。这种方式的演奏，在低音区，是低音提琴的声音主导的，在中高音区，则是大提琴声音为主导。有不太常见的例子，是大提琴和低音提琴先后演奏同一段旋律，造成特殊的对比效果，例如肖斯塔科维奇的第七交响曲第一乐章。
19世纪后，大提琴逐渐从纯低音乐器中解脱出来，在交响乐中经常脱离低音提琴而演奏旋律。这时，低音就全留给低音提琴了，但为了让其低音线条清楚，往往在其上面附加管乐，来重复低音提琴的音符，这样，低音提琴虽然是弦乐中的一员，却经常有机会和长号、大号、巴松管等乐器演奏同一段旋律。
低音提琴在现代交响乐队里是相对比较不起眼，却十分重要的角色。
