美洲大赤鱿(DosidicusGigas)在食品加工过程中的软骨废弃物为原料,建立包括粉碎、脱水脱脂、酶解、除蛋白、醇沉、离子交换、脱盐等操作流程的CS制备方法,制备得到新型CS。最终产品的产率达到16±2%。用商品化的硫酸软骨素ABC酶、硫酸皮肤素酶、透明质酸酶(来自于StreptomycesHyalurolyticus)、以及实验室自有产权的rHCLase降解所得多糖,根据酶的底物专一性,确认所制备的多糖为CS；通过咔唑反应检测样品中新型CS含量,BCA蛋白定量法检测样品中蛋白含量。结果提示：样品中新型CS含量达到97%以上,蛋白含量低于2%。2.新型CS多糖结构的初步分析：参照葡聚糖分子量标准物,经凝胶过滤HPLC分析,确定所制备的NER-CS多糖平均分子量约为623.2 kDa。再通过硫酸软骨素ABC酶完全降解,结合HPLC分析二糖组成,发现NER-CS主要含有GlcAβ1-3GalNAcGlcAβ1-3GalNAc(4S)、GlcAβ1-3GalNAc(6S)、E-unit,其中E-unit含量最高可达44.5%,同时GlcAp1-3GalNAc、GlcAβ1-3GalNAc(4S)]、GlcAβ1-3GalNAc(6S)]含量分别为7.1%、12.6%、35.8%,总硫酸化度为1.37。是一种新型高硫酸化CS。3NER-CS生物活性的初步分析：1)用Aglyco试剂盒检测NER-CS的抗凝血活性,结果显示：NER-CS抗FⅡa和抗FXa活性分别为20±2U/mg和0.9±0.2U/mg,是阳性对照肝素抗FⅡa活性的10%左右,抗FXa活性的4%左右；2)利用乳腺癌4T1细胞试验转移模型,分析NER-CS在小鼠体内抗肿瘤转移活性,结果显示：50、100和200μgNER-CS的抑瘤率分别为54.3±2.5%、75.1±3.5%、42.9±2.1%,同时阳性对照100μg肝素的抑瘤率为74.6±1.8%；3)用亲和素修饰的CM5芯片固定生物素化NER-CS,分析NER-CS与五种生长因子、三种选择素的相互作用活性,结果显示NER-CS与生长因子HGF、bFGF相互作用活性较高,亲和力常数分别为(3.47±1.73)x10-6、(5.39±2.92)x10-8。4.NER-CS寡糖的制备及其抗肿瘤活性分析。
