1967年，施一公出生在河南省郑州市小郭庄。1972年，离开小郭庄，全家搬往之外的驻马店市。1984年毕业于河南省实验中学，并获全国高中数学联赛一等奖（河南省第一名），保送至清华大学生物科学与技术系，1989年提前一年毕业，获得学士学位。
1995年获美国约翰·霍普金斯大学医学院分子生物物理博士学位，随后在美国纪念斯隆·凯特琳癌症中心进行博士后研究。
1998年—2008年，历任美国普林斯顿大学分子生物学系助理教授、副教授、终身教授、Warner-Lambert/Parke-Davis讲席教授。
2008年，婉拒了美国霍华德休斯医学中心（HHMI）研究员的邀请，全职回到清华大学工作，任清华大学生命科学学院院长，教授、博导。
2013年4月25日当选为美国艺术与科学学院院士；4月30日当选美国国家科学院外籍院士；
2013年12月19日当选中国科学院院士。
2013年9月13日，瑞典皇家科学院（Royal Swedish Academy of Sciences）宣布授予清华大学施一公教授2014年度爱明诺夫奖（Gregori Aminoff Prize）。
2014年12月9日施一公以校长助理身份，会见匈牙利罗兰大学校长巴纳·德布勒森一行。
2014年12月11日证实，施一公教授已出任清华大学校长助理。
2015年8月，施一公拟出任清华大学副校长。
2015年9月，中科院院士施一公出任清华大学副校长。
2016年3月25日，施一公获“影响世界华人大奖”。
2016年6月2日，中国科协第九次全国代表大会举行第九届全委会第一次会议，施一公当选中国科学技术协会第九届全国委员会副主席。
2018年1月9日，施一公已请求辞去清华大学副校长职务，筹建西湖大学。
2018年4月16日，施一公当选西湖大学首任校长。
2019年9月18日，施一公当选为浙江省欧美同学会会长，同时是欧美同学会总会的副会长和常务理事。
施一公出生在一个知识分子家庭，有两个姐姐、一个哥哥。父亲毕业于哈尔滨工业大学，母亲毕业于北京矿业学院。施一公的名字带着深深的时代烙印：父母亲给他取名“一公”，希望他“一心为公”。1985年，施一公被保送到清华生物系，成为清华大学生物系复系后的首届本科生。清华园里的施一公学习成绩年年名列全年级第一。1989年，他又以第一名的成绩提前一年毕业。在出色完成生物系课程的同时，他还获得了数学系的学士学位。
施一公注重全面发展，在高中期间，他就练习长跑，练过的项目从800米到1500米，再到3000米。进入清华后，由于长跑队只招收专业运动员，施一公便转练竞走，从5000米到1万米。他还在校运动会上创下全校竞走项目的纪录。一直到1994年，在他大学毕业五年后，这个纪录才被打破。
施一公的祖父是原上海市人大常委会副主任施平，云南大姚人。父亲出生于浙江杭州，但生长于江苏、上海等地，母亲来自江苏丹阳的吕城镇，高中毕业后考入北京矿业学院。父母大学毕业后选择到河南工作。施一公出生在河南郑州，两岁半就随父母下放到河南省中南部的驻马店市汝南县老君庙乡闫寨大队小郭庄，1972年，全家搬往驻马店市。
1990年初，施一公赴美深造，在美国约翰·霍普金斯大学医学院攻读生物物理学及化学博士学位。
施一公初到美国时，最先发现的差距就是英语不行。他给自己规定每天背25个新单词。科研上，他勤思苦干，持之以恒。有一次，系主任兼实验室导师自认为发现了一个生物物理学中重大理论突破，激动地向学生们演示。施一公当场敏锐地指出导师在一个演算上的错误。从此，导师对他刮目相看。毕业时，导师公开宣布“施一公是我最出色的学生”。
1997年4月，施一公还未完成博士后研究课题，就被普林斯顿大学分子生物学系聘为助理教授。此后，普林斯顿大学给他提供了面积达200平方米的实验室和近50万美元的启动基金。在当时，这样的待遇是很多人都无法企及的。良好的科研条件和机制为施一公提供了施展才华的空间。短短9年间，他就获得了普林斯顿大学最高级别的教授职位，并很快成为学校分子生物学系的领军人物。
施一公的妻子也是清华大学生物系的本科生、约翰霍普金斯大学的博士，他们有一对龙凤胎儿女。
已是国际著名结构生物学家、美国普林斯顿大学终身讲席教授的施一公，面对广阔的事业发展前景，面对优越的生活条件，他却作出了一个让许多人为之惊讶而敬佩的决定：放弃这一切，全职回国，回到母校清华。在他看来，“爱国是最朴素的感情，有谁不爱自己的母亲呢？”经历攀登的艰辛，山顶总会有无尽的风光。如果仅仅因为科研，施一公不会回来。他有更高的理想和追求。
2008年2月，40岁的国际著名结构生物学家、美国普林斯顿大学终身讲席教授施一公，全职回到中国，受聘为清华大学终身教授、并出任清华大学生命科学与医学研究院副院长。
施一公说：“中国的科技和教育体制、中国大学的科研和教学，都与美国一流大学有相当的差距，中国正在为此而努力。我会发自内心地为清华、为中国科技和教育体制的进一步发展付出更多。”
回国时，他给普林斯顿大学校长的信中写道：“我回到清华，对普林斯顿大学的贡献会比身在普林斯顿大得多。我希望将来能进行更多的学生交流活动，使普林斯顿、耶鲁、哈佛等这些名校的本科生有机会到清华来、到中国来，因为这三所大学的学生很多都是美国未来的领导者，我希望美国这些优秀的人才在年轻的时候能在中国待上一段时间，真正了解中国。”
如今，施一公希望自己能在清华为本科生开设一门思想政治课，用他在国外曲折而真实的经历，激发同学们的爱国主义情感。
在普林斯顿大学，他运用结构生物学、生物物理和生物化学手段，研究癌症发生和细胞凋亡的分子机制。迄今为止，他在国际权威学术杂志发表学术论文百余篇，其中作为通讯作者在《细胞》发表11篇、《自然》发表7篇、《科学》发表3篇，这些工作系统地揭示了哺乳动物、果蝇和线虫中细胞凋亡通路的分子机理，已有若干研究成果申请专利，用于治疗癌症的药物研发。
2003年，由于在细胞凋亡和TGF-信号传导等领域的杰出工作，破解了这一类生命科学之谜，当时年仅36岁的施一公获得全球生物蛋白研究学会颁发的“鄂文西格青年研究家奖”，成为这一奖项设立17年以来首位获奖的华裔学者。
2005年，当选华人生物学家协会会长。
2010年，施一公获赛克勒国际生物物理学奖。赛克勒国际生物物理学奖（THE RAYMOND & BEVERLY SACKLER INTERNATIONAL PRIZE IN BIOPHYSICS）是由赛克勒夫妇捐赠设立，自2006年以来，每年奖励两到三位在国际生物物理学领域做出卓越成就、年龄在45岁以下的杰出科学家。
2013年4月30日，清华大学施一公教授当选2013年美国科学院外籍院士。此前2013年4月25日，他还当选美国人文与科学学院外籍院士。耶鲁大学终身冠名教授邓兴旺和陈雪梅、杨薇等三名华裔美籍科学家，当选美国科学院新科院士。
2014年3月31日，施一公获瑞典皇家科学院爱明诺夫奖，奖励他过去15年运用X-射线晶体学在细胞凋亡研究领域做出的杰出贡献。施一公是首位获得该奖的中国科学家。
2014年4月3日在瑞典皇家科学院年会的颁奖典礼上，中科院院士、清华大学教授施一公获得2014年爱明诺夫奖，并成为首位获得该奖的中国科学家。瑞典国王卡尔十六世·古斯塔夫为施一公颁奖，以奖励其在过去15年间运用X射线晶体学在细胞凋亡研究领域作出的杰出贡献。据介绍，爱明诺夫奖由瑞典皇家科学院于1979年设立，用以奖励在晶体学领域作出重大贡献的科学家。该奖项每年颁给不超过3名科学家，施一公是2014年该奖项唯一获奖人。施一公是国际著名结构生物学家。自1998年以来，他领导的实验室主要结合X射线晶体结构生物学和生物化学手段，系统研究了细胞凋亡的发生和调控机制。他们的科研成果不仅清晰地揭示了细胞凋亡通路中的一系列分子过程，基于该研究的一项专利成果也已被转化为治疗癌症的新药进入二期临床试验。
曾获国际赛克勒生物物理学奖、香港求是科技基金会杰出科学家奖、谈家桢生命科学终身成就奖、瑞典皇家科学院颁发的2014年度爱明诺夫奖等奖项。美国艺术与科学院院士、美国国家科学院外籍院士、欧洲分子生物学组织外籍成员。
2015年12月8日，在《自然》杂志举办的“2015科研·创新·创业国际研讨会”上，施一公被授予2015年《自然》杰出导师奖。
2016年3月25日，“影响世界华人盛典”在北京清华大学举行，施一公获“影响世界华人大奖”。
2016年10月21日何梁何利基金颁奖在京举行，清华大学施一公教授荣获2016年度何梁何利基金最高奖项“科学与技术成就奖”。
2017年5月，获得全国创新争先奖。
2017年9月9日，施一公荣获“未来科学大奖-生命科学奖”，并获得获得100万美元奖金，以表彰他在解析真核信使RNA剪接体这一关键复合物的结构，揭示活性部位及分子层面机理的重大贡献。
2017年12月21日，施一公入选“2017年度中国留学人员50人榜单”。
2018年12月，入选“中国改革开放海归40年40人”榜单。
2008年2月，已成为美国普林斯顿大学终身讲席教授的施一公，毅然辞职回到母校清华大学，在海外华人界引起了不小的震动。美国国立健康研究院研究室主任、国际知名神经科学家鲁白说：“他是海外华人归国的典范和榜样”。
由中国科学报社、中国科协科普部、中国科技新闻学会等主办的“2013中国科学年度新闻人物”推选活动2014年1月24日晚正式揭晓，施一公为10位获奖者之一。
“他是闻名世界的结构生物学家，曾是美国普林斯顿大学分子生物学系建系以来最年轻的终身教授。2013年，他的科研小组研究进展不断：首次在RNA剪接通路中取得重大进展，为揭示生命现象的基本原理奠定了扎实的理论基础；他运用X-射线晶体学手段在细胞凋亡研究领域做出突出贡献，为开发新型抗癌、预防老年痴呆的药物提供了重要线索……2013年也是他收获荣誉的一年，他当选为中国科学院院士和美国科学院、美国艺术与科学院双院外籍院士。他在科研中不忘育人之心，他深受学生爱戴。他就是清华大学生命学院院长施一公。”
在美国生活了18年的施一公，2008年初全职回到清华大学工作，后来还放弃了美国国籍。他的归来被认为是中国科技界吸引力增强的标志之一。
