马氏的祖上曾是归德府宿州富豪。父亲马公家住新丰里，由于乐善好施，所以家业日渐贫困。母亲郑媪，在1332年生下马氏不久就去世了。马公没有儿子，视马氏为掌上明珠。马氏自幼聪明，能诗会画，尤善史书，性格也颇倔强。
马氏的父亲马公因为杀人避仇，逃亡他乡，临行时将爱女托付给生死之交郭子兴。郑媪早卒，其后马公也客死外地，郭子兴越发可怜此女孤苦，收为养女。郭子兴教她文化知识，夫人张氏则手把手教她针织刺绣。十几岁的马氏聪明无比，凡事一经指导，马上知晓。年近二十的马氏，模样端庄，神情秀越，还有一种温婉的态度，无论何等急事，她总举止从容，并没有疾言厉色，所以郭子兴夫妇很是钟爱马氏，一直想给她找一个好夫婿，使她终身有托，不辜负马公遗言。
元朝末年，政治腐败，社会黑暗，阶级压迫和民族压迫使老百姓处于水深火热之中，元至正四年（公元1344年），河南、江淮一带大旱，赤地千里，而黄河又接连决口，饥民遍野。到至正十一年（1351），河患已经连续六年，天灾人祸把广大农民推向死亡的边缘。这年五月，江淮流域终于爆发了以刘福通为首的大规模的红巾军起义。
1352年（至正十二年），郭子兴在定远（安徽定远）起兵响应。郭子兴聚众烧香，成为当地白莲教的首领，同年农历二月二十七日，率领起义军攻下濠州后，郭子兴自称元帅。
濠州钟离人朱元璋前来投奔郭子兴的义军，朱元璋入伍后精明能干，处事得当，打仗时身先士卒，获得的战利品全部都上交郭子兴元帅，得了赏赐，又说功劳是大家的，就把赏赐分给大家。不久，朱元璋在部队中的好名声传播开来。郭子兴也把他视作心腹知己，有重要事情总是和朱元璋商量 。
郭子兴见朱元璋是个人才，对自己的事业将会有很大的帮助。于是便把养女马氏许配给了朱元璋。马氏与朱元璋成亲后，和朱元璋感情深厚，追随朱元璋南征北战，精心辅佐朱元璋。
马氏与朱元璋婚后不久，收养了朱元璋的亲侄儿朱文正、外甥李文忠还有定远孤儿沐英，马氏对这三个养子视如己出，细心照顾。后来，马氏和朱元璋又收养了二十几个义子。
郭子兴虽然器重朱元璋，但他性情暴躁，忌才护短，又好听谗言，迟疑寡断，在别人的挑唆下，也曾多次猜疑朱元璋，对他加以斥骂。一次，郭子兴发怒，将朱元璋禁闭在空室，不许进食，马氏得知后，亲自到厨房，“窃炊饼，怀以进，肉为焦”。马氏见此情形，就把自家财产送给养母张夫人和郭子兴妾张氏，请她们在义父前给干女婿说点好话，以弥缝裂痕，使得朱元璋能脱离困境。朱元璋南下之时，马氏曾负责往来的文书，并做得井井有条，同时她还劝朱元璋不要扰民，更不要滥杀，深得朱元璋的赞赏。
元至正十五年（公元1355年），朱元璋率领大军渡江，马氏和将士的家眷仍留在和州（今安徽和县）。当时长江交通线被元军切断，和州孤立，马氏鼓励将士，抚慰眷属，稳定后方。攻下集庆（今南京市）以后，由于战争的需要，她还亲手为将士缝衣做鞋。元至正二十年（公元1360年），陈友谅率兵东下，直逼江宁（今江苏省南京市郊），朱元璋亲自领兵抵御。强敌兵临城下，城中的官员、居民有的打算逃难，有的忙着窖藏金银，囤积粮食。马氏却镇静自若，把自己的金帛全都拿出来犒赏士兵，稳定了军心，为朱元璋获得胜利起了重要作用。
1368年（洪武元年）正月，朱元璋登基于应天府（今南京），国号大明，建元洪武，册封马氏为皇后。
马皇后有五子，其中朱橚最为年幼，性格放荡不羁，长大后被封到开封做周定王。马皇后对他极不放心，周定王临行时，便派江贵妃随往监督，还把自己身上的旧布衣脱下来交给江贵妃，并赐木杖一根嘱咐：“周定王有过错，可以披衣杖责。如敢违抗，驰报朝廷。”从此一见着慈母的旧布衣，周王便生出敬畏之情，不敢胡作非为。以严为爱是马皇后对待子女的原则。对宁国公主、安庆公主，马皇后也要求她们勤劳俭朴，不能无功受禄。而对待朱元璋的义子沐英、李文忠等，她慈爱有加，细心照顾视为己出。
诸王的师傅李希颜因一小王顽皮不听话，常用体罚惩治。一天，李希颜用笔管戳了一下一个小王的额角，小王便哭着到朱元璋处诉苦。元璋大怒，正要发作，马皇后急忙从旁劝解说：“乌有以圣人之道训吾子，顾怒之耶！”朱元璋觉得有理，不但没有惩办希颜，反而提升他做左春坊右赞善。
马皇后虽贵为皇后，每天仍亲自操办朱元璋的膳食，连皇子皇孙的饭食穿戴，她也亲自过问，无微不至。宫人或被幸得孕，马皇后倍加体恤，嫔妃或忤上意，马皇后则设法从中调停。
马皇后在内宫的治理工作上“讲求古训”，并注意借鉴前朝的经验。她觉得宋朝有许多贤惠的皇后，便命女史摘录她们的家法，经常翻阅查看。有人说，宋朝的皇后太过仁厚了吧？马皇后反问道：“过于仁厚，难道不比刻薄更好吗？”有一天，皇后问女史：“黄老之学是什么，汉朝的窦太后却非常地喜欢？”女史说：“黄老之学把清静无为作为根本。像弃绝仁义，让老百姓注重孝顺友爱，这就是它的教义。”马皇后说：“孝顺友爱就是仁义，难道有让人弃绝仁义却去讲究孝顺友爱的吗？”
马皇后也设法保护宫女，朱元璋曾经非常生气地责备宫人，马皇后也假装生气，让人送到宫正司定罪。朱元璋说：“为什么？”马皇后说：“作帝王的不因喜怒而随意的赏罚。当您生气的时候，恐怕有所偏重。交付到宫正司，就能判定的比较合理了。也就是说陛下您定人罪也应该交付到有关的部门罢了。”
马皇后勤俭持家、 以身作则，平常穿的衣服，洗了又洗，早已破旧不堪，也不愿换新的。后来听了元世祖的察必皇后煮弓弦织帛衣的故事，大受启发。就命人在后宫架起织布机，亲自织些绸衣料、缎被面什么的，然后以皇家献爱心的名义赐给那些年纪大的孤寡老人。而剩余的布料，马皇后则裁成衣裳，赐给王妃公主，并解释说：”你们生长在富贵家庭，不知纺织的难处，要爱惜财物。“
朱元璋在前殿处理事情，有时非常生气，马皇后等朱元璋回到后宫，常常依据事理委婉地劝阻。朱元璋的性格虽然刚毅，但因为马皇后的劝阻而能够减免刑罚的人也有很多。
参军郭景祥守卫和州，有人告密说他的儿子拿着槊想杀他的父亲，朱元璋听后大怒，想要杀了郭景祥的儿子。马皇后说：“郭景祥只有一个孩子，别人告密的也许不是实际情况，杀了他恐怕就会断绝郭景祥的后代。”朱元璋认真了解情况后，发现他果然是冤枉的。
朱元璋的义子李文忠守卫严州，杨宪诬告他不遵守法律，朱元璋想召李文忠回来。马皇后说：“严州，是面临敌境的地方，随便的更换将领不合适。况且李文忠向来贤明，杨宪的话难道可以相信吗？”朱元璋于是停止了这件事。李文忠后来终于建立了大功。
学士宋濂因为孙慎的事情而获罪，被抓来定为死罪，马皇后劝阻朱元璋说：“普通百姓家为孩子请老师，尚且将尊师之礼奉行一生，何况我们天子之家呢？况且宋濂住在家里，一定不知道实情。”朱元璋不听。正好赶上马皇后侍奉朱元璋吃饭，马皇后不饮食酒肉。朱元璋问原因。马皇后回答说：“我在为宋先生作福事。”朱元璋内心也感到凄然，于是放下筷子站起。第二天赦免了宋濂的死罪，把他安置到茂州。
吴兴富户沈万三多年在海外经商，为全国第一富户，被迫捐献家财助修都城城墙的三分之一，后又被迫出资犒劳军队。事情被朱元璋闻知，不料触犯了忌讳，大怒说：“匹夫犒天子军，乱民也，宜诛。”高皇后劝谏说：“妾闻法者，诛不法也，非以诛不祥。民富敌国，民自不祥。不祥之民，天将灾之，陛下何诛焉。”经马皇后劝说，沈万三才得免去死罪，遣戍云南。
朱元璋曾经让重刑犯筑造城墙。马皇后说：“通过罚劳役来赎罪，这是国家对待犯有重罪的囚犯的最大的恩惠，但本来就疲惫的囚犯如果再加重劳役，恐怕仍免不了死亡。”朱元璋于是全都赦免了他们。
马皇后非常爱惜人才。一次朱元璋视察太学回来，马皇后问他太学有多少学生，朱元璋答有数千人。马皇后说：“数千太学生，可谓人才济济。可是太学生虽有生活补贴，他们的妻子儿女靠什么生活呢？”针对这种情况，马皇后征得朱元璋同意，征集了一笔钱粮，设置了20多个红仓，专门储粮供养太学生的妻子儿女，生徒颂德不已。
一天，马皇后问朱元璋：“如今天下的老百姓生活安定吗？”朱元璋说：“这不是你应该问的。”马皇后说：“陛下您是天下人的父亲，我有幸能成为天下人的母亲，孩子的安定与否，我怎么可以不问！”每当遇到灾年，马皇后就率领宫人吃粗茶淡饭，帮助百姓祈祷。朱元璋有时把赈灾救济的事情告诉马皇后，马皇后就说：“赈灾救济不如事先有积蓄好。”有时朝廷官员上奏完事情，在宫廷中聚餐，马皇后就命令宦官拿来酒菜自己事先尝一尝。味道不好，于是就告诉朱元璋说：“作为人主奉养自己应该差一些，奉养别人应该丰厚。”朱元璋为此整顿了光禄寺的官员。
朱元璋做了皇帝以后，想寻找马皇后的族人分封官爵，马皇后拒绝说：“分封爵禄偏爱外戚之家，不合乎法律。”马皇后坚决拒绝才停止了这件事。然而有时谈到父母早亡，马皇后常常痛哭流涕。
1382年（洪武十五年）农历八月，马皇后在睡觉的时候得病。群臣请求祈祷祭祀，求取太医院的良医诊治。马皇后对朱元璋说：“死生，是命运的安排，祈祷祭祀有什么用处呢！况且医生又怎能使人活命！如果吃药不能见效，恐怕会因为我的缘故而降罪各位医生吧？”病情加重时，朱元璋问她想说什么。马皇后说：“希望陛下能够求取贤能的人，听取别人的意见，自始至终，认真对待，子孙都能够贤能，大臣百姓都能够有所依靠罢了。”
马皇后在1382年（洪武十五年）农历八月丙戌日（八月二十四）去世，享年五十一岁。朱元璋非常伤心，于是从此不再立皇后。
《明史》：后仁慈有智鉴，好书史。后勤于内治，暇则讲求古训。母仪天下，慈德昭彰。
蔡东藩：她总举止从容，并没有疾言遽色。的是国母风范。
